PCR ali polimerazna verižna reakcija je sofisticirana laboratorijska tehnika, ki se pogosto uporablja v medicini in na drugih znanstvenih področjih. Diagnostika PCR je nekoč postala pravi preboj v znanosti.
Opis
Kvantitativni PCR je vrsta PCR v realnem času.
To razumemo kot različico PCR, pri kateri se kinetika reakcije nenehno beleži, kar omogoča kvalitativno oceno vsebnosti specifičnih zaporedij nukleotidov DNK v kompleksni molekularni mešanici.
Kvantitativna metoda PCR bo podrobneje obravnavana spodaj.
Bistvo analize
Kulturalne in serološke metode se še posebej pogosto uporabljajo za diagnosticiranje okužb. Pri prvem se določijo protitelesa proti infekcijskemu patogenu v krvnem serumu. V drugem primeru se biološki material, vzet od bolne osebe, uporabi za setev specifičnega gojišča, ki je ugodna za rast kolonij patogenov. Diagnostika v obehprimer lahko traja dneve ali tedne.
PCR preiskavo lahko opravimo z različnimi biološkimi materiali, ki jih dobimo od bolne osebe. Kot vzorci delujejo kri in drugi patološki, fiziološki in biološki mediji ter tekočine. Lahko naredite PCR iztrebkov ali urina.
Atipične in virusne okužbe najpogosteje diagnosticiramo s kvantitativnim PCR, saj jih zaradi specifične narave patološkega procesa, ki ga izzovejo, morda ni enostavno diagnosticirati. Za ugotavljanje tovrstnih okužb je potreben čas, v katerem se v telesu začnejo proizvajati protitelesa, določena s serološkimi metodami. Toda to je v nekaterih primerih nesprejemljivo.
Način izvajanja
PCR metoda - laboratorijsko odkrivanje okužbe v vzorcih, izoliranih od pacienta (in vitro).
Za izvedbo verižne reakcije s polimerazo je potreben nabor posebnih reagentov.
Preskusni material se vnese v epruvete z reagenti. Epruvete so nameščene v posebno napravo - PCR ojačevalnik, ki je zasnovan za pomnoževanje (povečanje števila) želenih fragmentov RNA ali DNK, PCR ojačevalnik deluje v cikličnem načinu. V katerem koli ciklu, če vzorci vsebujejo zaporedje RNA ali DNK patogena, se v raztopini kopiči vedno več kopij delcev teh nukleinskih kislin. V vzorcih lahko določite prisotnost patogena in njegovo količino.
Vrste PCR
Kvalitativna analiza s PCR vam omogoča, da dobite naslednji rezultat:
- negativno, če v vzorcih ni najdenega patogena;
- pozitivno, če v vzorcih najdemo sekvence, ki so značilne za določen patogen.
S pozitivnim rezultatom PCR lahko s 95-odstotno natančnostjo govorimo o prisotnosti diagnosticirane okužbe. Hkrati natančnost PCR kompletov, ki se uporabljajo za diagnostične namene, doseže 100%.
Običajno 5 % napačnih rezultatov določa človeški faktor. Na primer, kršitve tehnike analize in shranjevanja reagentov lahko znatno zmanjšajo natančnost študije.
Kvantitativni PCR opredeljuje koncept virusne obremenitve. Določiti je mogoče, koliko sklopov DNK patogena je bilo v vzorcih, odvzetih od pacienta.
Resnost okužbe je neposredno sorazmerna s povečanjem njihovega števila. Določite lahko tudi uspešnost terapije za zmanjšanje virusne obremenitve.
Oddaja za PCR biomaterial
Kvantitativna PCR se izvaja v ambulanti, predvsem zjutraj. Med obiskom pri zdravniku bo pacient povedal, kaj je treba vzeti: strganje, brise, urin ali kri. PCR lahko odkrije patogene ne glede na stopnjo kontaminacije materiala.
Za pozitivno analizo je teoretično potrebna prisotnost samo enega patogena v vzorcih. V praksi poskušajo ustvariti še ugodnejše pogoje. Za to obstaja nekaj priporočil:
- če vzamejo strganje ali bris iz genitalijorganov, se morate vzdržati intimnih odnosov tri dni pred študijo;
- pred analizo se ne morete izpirati z antibakterijskimi zdravili ali se umivati;
- tri ure pred odvzemom brisa iz sečnice morate biti potrpežljivi in ne izprazniti črevesja.
Pri darovanju krvi ne upoštevajte teh pravil.
Kako se razlagajo rezultati kvantitativne PCR analize?
Kvantitativna ocena dobljenih rezultatov
V številnih kliničnih situacijah se pojavlja problem učinkovitosti zdravljenja in/ali dinamike patološkega procesa. Takšna vprašanja so še posebej pomembna pri pregledu ljudi s kroničnimi okužbami (virus humane imunske pomanjkljivosti, hepatitis B in C). Pri diagnosticiranju temeljijo na dejstvu, da je kopičenje amplikonov (produktov PCR) sorazmerno s prisotnostjo kopij želenega gena v analiziranem vzorcu.
Seveda se ob upoštevanju rezultatov kvantitativne PCR izvaja gel elektroforeza s preučevanjem intenzivnosti posebnih PCR signalov. Prav tako so predpogoj za pravilno kvantitativno oceno dobljenih rezultatov pozitivni zanesljivi kontrolni vzorci, ki vsebujejo znano število kopij želenega gena (na primer tisoč kopij gena za hepatitis C za eno reakcijo PCR). Več serijskih razredčitev kvantitativne kontrole omogoča ustvarjanje kalibracijskih krivulj in se uporabljajo za vrednotenje vsebine kliničnih genokopija v kliničnih vzorcih.
V definiciji kvantitativnega PCR je bil ključni dosežek ustvarjanjefluorescenčne DNK sonde, ki se dodajajo reakcijski mešanici hkrati s preprostimi primerji in vam omogočajo, da pravočasno spremljate proces PCR, to je PCR v realnem času.
Metodologija TaqMan se nanaša na sintezo fluorescenčnih DNK sond, ki so specifične za srednji del amplikona in imajo dve nalepki na koncih. Ena od njih je fluorescenčna oznaka, druga je molekula za gašenje te fluorescence.
Posebna naprava, ki je hibrid fluorimetra in termoblok-ojačevalnika, izvaja stalne meritve fluorescence v vsaki epruveti (princip PCR v realnem času). Po 20-40 ciklih PCR se za vsak vzorec dobijo posamezne krivulje. Število kopij želenega gena, ki ga vsebuje testni vzorec, se lahko izračuna iz kalibracijskih krivulj s kontrolnimi vzorci.
Pomembna značilnost izvajanja PCR s fluorescentno metodo je tudi ta, da ob upoštevanju rezultatov ni treba odpirati epruvet z mešanico PCR. S tem se zmanjša možnost kontaminacije prostora z ojačevalnimi produkti in ni potrebe po dodeljevanju posebnih delovnih površin za elektroforezo.
Kaj pokaže kvantitativni PCR prepis?
Kaj se odkrije?
S pomočjo metode, kot je kvantitativni PCR, se odkrijejo kvalitativne spremembe v genih: vstavitve, delecije in točkovne mutacije. Toda pri nekaterih dednih motnjah se ustrezni simptomi pojavijo kot odgovor na spremembo vsebine določenih genov.
HvalaKvantitativna analiza daje številčni rezultat, najpogosteje v ie / ml. To pomeni, da je bilo v enem mililitru testnega vzorca ugotovljeno določeno število kopij RNA ali DNK patogena, merjeno v mednarodnih enotah.
Odvisno od obsega se diagnosticira resnost okužbe. Kri se običajno testira za določitev virusne obremenitve, saj se virusi med boleznijo prosto gibljejo v krvi.
Funkcije
Kvantitativni PCR v krvnem testu ima dve značilnosti.
- Analiza se izvaja v prisotnosti primerjev ali deoksiribonukleozid trifosfatov, ki so označeni s fluorescentno ali radioaktivno oznako za natančno določitev vsebine oblikovanega produkta PCR.
- V postopku PCR zaključite reakcijo zgodaj, preden se pojavi preveč produktov PCR. To je posledica dejstva, da v končni fazi nasičenosti, ko je veliko produktov PCR, tako sam encim kot substrati delujejo kot omejevalne vezi te reakcije. Za konec naslednjega cikla PCR v takšnih pogojih ni več značilno podvojitev števila produktov PCR, izenačijo se nepomembne količinske razlike med različnimi vzorci, ki so precej jasno opredeljene v zgodnjih fazah po prehodu skozi vrsto reakcijskih ciklov..
Stroški PCR diagnostike
PCR raziskava ima strošek, ki je odvisen od vrste okužbe, ki se bo testirala, od metodologije analize in testnega materiala. Če želite določiti eno okužbo, se boste morali vdati200-800 rubljev. Dodana je tudi pristojbina za odvzem biomateriala - približno 400 rubljev.
