Kromatografija je ena od metod za ločevanje snovi. Uporablja se za naknadno kvalitativno in kvantitativno analizo fizikalnih in kemijskih lastnosti mikrodelcev. Različica te tehnologije je afinitetna kromatografija. Zamisel o diferenciranju beljakovinskih spojin z uporabo lastnosti molekularne afinitete je v znanosti znana že nekaj desetletij. Vendar se je razvil šele v zadnjih letih, po uvedbi visoko poroznih hidrofilnih materialov, ki se uporabljajo kot matrika. Ta metoda omogoča reševanje tako analitičnih problemov (ločevanje snovi in njihova identifikacija) kot pripravljalnih problemov (čiščenje, koncentracija).
Essence
Afinitetna kromatografija (iz latinske besede affinis - "sosednji", "sorodni") temelji na afinitetnih interakcijah, ki so tvorba visoko specifičnih vezi med molekulo distančnika (ligandom ali afinantom) in ciljno molekulo. Ti mehanizmi so v naravi zelo razširjeni (povezava mediatorjev ali hormonov in receptorjev, protiteles inantigeni, hibridizacija polinukleotidov in druge vrste procesov). V medicini se afinitetna kromatografija uporablja v praktične namene od leta 1951
Komponente so ločene na naslednji način:
- delovna raztopina, ki vsebuje snov, ki jo je treba izolirati, se spusti skozi sorbent;
- ligand, odložen na matriks sorbenta, zadrži to snov;
- je koncentriran (akumulacija);
- ekstrakcija izolirane snovi iz sorbenta s pranjem s topilom.
Ta metoda vam omogoča izolacijo celih celic. Razlika od tradicionalne sorpcijske kromatografije je v tem, da obstaja močna biospecifična vezava izolirane komponente na sorbent, za katero je značilna visoka selektivnost.
Adsorbenti
Naslednje snovi se uporabljajo kot adsorbenti:
- Gel spojine na osnovi agaroze, polisaharida, pridobljenega iz agarja. Najpogosteje uporabljene so 3 sorte: sefaroza 4B, CL (zamrežena agaroza) in affi-gel. Slednja sestava je modificiran gel agaroze in poliakrilamida. Ima večjo biološko inertnost, visoko kemično in toplotno odpornost.
- Silicij (silikagel).
- Steklo.
- Organski polimeri.
Za odpravo mehanskih ovir med stikom z ligandom se uporabljajo dodatne snovi za ločevanje le-tega od nosilca (peptidi, diamini, poliamini, oligosaharidi).
Oprema
Oprema za afinitetno kromatografijo vključuje naslednje glavne enote:
- rezervoarji za mobilno fazo (eluent);
- visokotlačne črpalke za srednji dovod (najpogosteje batne);
- filter za čiščenje eluentov iz prahu;
- dozirna naprava;
- kromatografska kolona za ločevanje mešanice;
- detektor za zaznavanje ločenih komponent, ki zapuščajo stolpec;
- kromatogramski snemalniki in mikroprocesorska enota (računalnik).
Da bi zmanjšali količino raztopljenega zraka, helij najprej spustimo skozi mobilno fazo. Za spreminjanje koncentracije eluenta je nameščenih več črpalk, ki jih krmili programator. Kromatografske kolone so izdelane iz nerjavnega jekla (za povečane zahteve glede odpornosti proti koroziji), stekla (univerzalna možnost) ali akrila. Za pripravljalne namene se lahko njihov premer giblje od 2 do 70 cm. Pri analizni kromatografiji se uporabljajo mikrokolone Ø10-150 µm.
Za povečanje občutljivosti detektorjev se v mešanico vnesejo reagenti, ki prispevajo k tvorbi snovi, ki absorbirajo več žarkov v ultravijoličnem ali vidnem območju spektra.
metodologija
Obstajata 2 glavni vrsti tekoče afinitetne kromatografije:
- Stolpec, v katerem je kolona napolnjena s stacionarno fazo in skozi njo s tokom prehaja mešanicaeluent. Ločitev se lahko zgodi pod pritiskom ali gravitacijo.
- Tanka plast. Eluent se pod vplivom kapilarnih sil premika vzdolž ravni adsorbentne plasti. Adsorbent se nanese na stekleno ploščo, keramično ali kremenovo palico, kovinsko folijo.
Glavne faze dela vključujejo:
- priprava adsorbenta, fiksacija liganda na nosilec;
- dovajanje ločevalne mešanice v kromatografsko kolono;
- mobilno fazno nalaganje, vezava komponent z ligandom;
- zamenjava faze za izolacijo vezane snovi.
Destinacija
Afinitetna kromatografija se uporablja za izolacijo naslednjih vrst snovi (vrsta uporabljenega liganda je navedena v oklepajih):
- analogi encimskih inhibitorjev, substratov in kofaktorjev (encimov);
- bioorganske snovi z znaki genetske tujosti, virusi in celice (protitelesa);
- ogljikovi hidrati z visoko molekulsko maso, monosaharidni polimeri, glikoproteini (lektini);
- jedrske beljakovine, nukleotidiltransferaze (nukleinske kisline);
- receptorji, transportne beljakovine (vitamini, hormoni);
- proteini v interakciji s celičnimi membranami (celicami).
Ta tehnologija se uporablja tudi za pridobivanje imobiliziranih encimov, njihova vezava na celulozo pa omogoča proizvodnjo imunosorbentov.
kromatografija proteinov, ki vežejo DNA
Izolacija proteinov, ki vežejo DNA, se izvede z uporaboheparin. Ta glikozaminoglikan je sposoben vezati širok spekter molekul. Afinitetna kromatografija beljakovin te skupine se uporablja za izolacijo snovi, kot so:
- faktorji iniciacije in elongacije translacije (sinteza molekul nukleinske kisline in beljakovin);
- restriktaze (encimi, ki prepoznajo določena zaporedja v dvoverižni DNK);
- DNA ligaze in polimeraze (encimi, ki katalizirajo spajanje dveh molekul, da tvorijo novo kemično vez in sodelujejo pri podvajanju DNK);
- zaviralci serinske proteaze, ki igrajo pomembno vlogo pri imunskih in vnetnih procesih;
- rastni dejavniki: fibroblast, Schwann, endotel;
- proteini zunajceličnega matriksa;
- hormonski receptorji;
- lipoproteini.
Dignity
Ta metoda je ena najbolj specifičnih za izolacijo reaktivnih spojin (encimov in večjih agregatov – virusov). Vendar se ne uporablja samo za izolacijo biološko aktivnih snovi.
Odkrivanje protiteles v majhnih količinah, kvantitativna ocena poliadenilne kisline, hitro določanje molekulskih mas dehidrogenaz, odstranjevanje določenih onesnaževal, študija kinetike aktivacije neaktivne oblike tripsina, molekularna struktura človeka interferoni - to ni celoten seznam študij, v katerih se uporablja afiniteta.kromatografija. Uporaba v kliniki je posledica njenih prednosti, kot so:
- Zmogljivost učinkovitega čiščenjabeljakovine, polisaharidi, nukleinske kisline. Nekoliko se razlikujejo po svojih fizikalnih in kemičnih lastnostih in izgubijo aktivnost med hidrolizo, denaturacijo in drugimi vrstami obdelave, ki se uporabljajo pri drugih metodah.
- Hitrost ločevanja snovi, dinamična narava procesa.
- Ni potrebe po posebnem čiščenju encimov in homogenizaciji izoencimov za določitev disociacijskih konstant.
- Zmožen ločiti širok spekter snovi.
- Nizka poraba ligandov.
- Možnost ločevanja snovi v velikih količinah.
- Reverzibilni proces vezave bioloških makromolekul.
To tehniko lahko kombiniramo z drugimi, da naložimo dodatno polje (gravitacijsko, elektromagnetno). To vam omogoča, da razširite tehnične zmogljivosti kromatografije.
Encimatski inženiring
Zahvaljujoč tej metodi se je začel aktiven razvoj nove veje biotehnologije - encimskega inženiringa.
Afinitetna kromatografija za izolacijo encimov ima naslednje prednosti:
- pridobivanje encimov v velikih količinah zaradi krajšega časa, posledično - njihovo znižanje cene;
- imobilizacija encimov lahko znatno razširi obseg njihove uporabe v medicini in industriji;
- Povezava encimov z netopno trdno podlago omogoča preučevanje vpliva mikrookolja in smeri reakcij, ki igrajo pomembno vlogo v naravnih in fizioloških procesih.
