Za določitev kvalitativne sestave številnih živilskih izdelkov se uporablja ksantoproteinska reakcija za beljakovine. Prisotnost aromatskih aminokislin v spojini bo pozitivno spremenila barvo testnega vzorca.
Kaj so beljakovine
Imenuje se tudi beljakovina, ki je gradbeni material za živi organizem. Beljakovine ohranjajo mišični volumen, obnavljajo poškodovane in odmrle tkivne strukture različnih organov, pa naj gre za lase, kožo ali ligamente. Z njihovo udeležbo nastajajo rdeče krvne celice, uravnava se normalno delovanje številnih hormonov in celic imunskega sistema.
To je kompleksna molekula, ki je polipeptid z maso, večjo od 6103 d altonov. Strukturo beljakovin tvorijo aminokislinski ostanki v velikih količinah, povezani s peptidno vezjo.
Proteinska struktura
Posebnost teh snovi v primerjavi s peptidi z nizko molekulsko maso je njihova razvita prostorska tridimenzionalna struktura, podprta z vplivi različnihstopnja privlačnosti. Beljakovine imajo štiristopenjsko strukturo. Vsak od njih ima svoje značilnosti.
Primarna organizacija njihovih molekul temelji na zaporedju aminokislin, katerega strukturo prepoznamo po ksantoproteinski reakciji na protein. Takšna struktura je periodično ponavljajoča se peptidna vez -HN-CH-CO-, selektivni del pa so radikali stranske verige v aminokarboksilnih kislinah. Prav oni določajo lastnosti snovi kot celote v prihodnosti.
Primarna struktura beljakovin velja za dovolj močno, to je posledica prisotnosti močnih kovalentnih interakcij v peptidnih vezi. Oblikovanje naslednjih stopenj se pojavi glede na znake, ugotovljene v začetni fazi.
Nastajanje sekundarne strukture je možno zaradi zvijanja aminokislinskega zaporedja v spiralo, v kateri se med zavoji vzpostavljajo vodikove vezi.
Terciarna raven organizacije molekule nastane, ko se en del vijačnice nadgradi na druge fragmente s pojavom vseh vrst vezi med njimi, z vodikovo, disulfidno, kovalentno ali ionsko spojino. Rezultat so asociacije v obliki kroglic.
Prostorska razporeditev terciarnih struktur s tvorbo kemičnih vezi med njimi vodi do tvorbe končne oblike molekule oziroma kvartarne ravni.
aminokisline
Določajo kemijske lastnosti beljakovin. Obstaja približno 20 glavnih aminokislin,vključeni v sestavo polipeptidov v različnih zaporedjih. Sem spadajo tudi redke aminokarboksilne kisline v obliki hidroksiprolina in hidroksilizina, ki sta derivata bazičnih peptidov.
Kot znak ksantoproteinske reakcije prepoznavanja beljakovin, prisotnost posameznih aminokislin daje spremembo barve reagentov, kar kaže na prisotnost specifičnih struktur v njihovi sestavi.
Kot se je izkazalo, so vse karboksilne kisline, v katerih je bil atom vodika nadomeščen z amino skupino.
Primer strukture molekule je strukturna formula glicina (HNH− HCH− COOH) kot najpreprostejše aminokisline.
V tem primeru je mogoče enega od vodikov CH2- ogljik nadomestiti z daljšim radikalom, vključno z benzenskim obročem, amino, sulfo, karboksi skupinami.
Kaj pomeni reakcija ksantoproteina
Za kvalitativno analizo beljakovin se uporabljajo različne metode. Ti vključujejo reakcije:
- biuret z vijolično barvo;
- ninhidrin za tvorbo modro-vijolične raztopine;
- formaldehid z rdečim madežem;
- Folija s sivo-črno sedimentacijo.
Pri izvajanju vsake metode se dokaže prisotnost beljakovin in prisotnost določene funkcionalne skupine v njihovi molekuli.
Obstaja ksantoproteinska reakcija na beljakovine. Imenuje se tudi Mulderjev test. Nanaša se na barvne reakcije na beljakovinah, vki so aromatične in heterociklične aminokisline.
Značilnost takega testa je proces nitriranja cikličnih aminokislinskih ostankov z dušikovo kislino, zlasti dodajanje nitro skupine benzenovemu obroču.
Rezultat tega procesa je tvorba nitro spojine, ki se obori. To je glavni znak ksantoproteinske reakcije.
Katere aminokisline so določene
S tem testom ni mogoče zaznati vseh aminokarboksilnih kislin. Glavna značilnost ksantoproteinske reakcije prepoznavanja beljakovin je prisotnost benzenskega obroča ali heterocikla v molekuli aminokisline.
Iz beljakovinskih aminokarboksilnih kislin ločimo dve aromatični kislini, v katerih sta fenilna skupina (v fenilalaninu) in hidroksifenilni radikal (v tirozinu).
Ksantoproteinska reakcija se uporablja za določanje heterociklične aminokisline triptofan, ki ima aromatično indolno jedro. Prisotnost zgornjih spojin v beljakovini daje značilno spremembo barve testnega medija.
Kateri reagenti se uporabljajo
Za izvedbo ksantoproteinske reakcije boste morali pripraviti 1% raztopino jajčnih ali rastlinskih beljakovin.
Navadno uporabite piščančje jajce, ki ga razbijete, da dodatno ločite beljakovine od rumenjaka. Za pridobitev raztopine 1% beljakovin razredčimo v desetkratni količini prečiščene vode. Po raztapljanju beljakovin je treba nastalo tekočino filtrirati skozi več plasti gaze. To raztopino hranite na hladnem.
Reakcijo lahko izvedete z rastlinskimi beljakovinami. Za pripravo raztopine se uporablja pšenična moka v količini 0,04 kg. Dodamo 0,16 l prečiščene vode. Sestavine zmešamo v bučki, ki jo postavimo za 24 ur na hladno mesto s temperaturo približno + 1 ° C. Po enem dnevu raztopino pretresemo, nato jo najprej filtriramo z vato, nato pa s papirnatim nagubanim filtrom. Nastalo tekočino hranimo na hladnem. V takšni raztopini je predvsem albuminska frakcija.
Za izvedbo ksantoproteinske reakcije se kot glavni reagent uporablja koncentrirana dušikova kislina. Dodatni reagenti so raztopina 10% natrijevega hidroksida ali amoniaka, raztopina želatine in nekoncentriran fenol.
metodologija
V čisto epruveto dodajte 1% raztopino jajčnih beljakovin ali moke v količini 2 ml. Dodamo ji približno 9 kapljic koncentrirane dušikove kisline, da preprečimo izpadanje kosmičev. Nastalo zmes segrejemo, zaradi česar oborina porumeni in postopoma izgine, njena barva pa preide v raztopino.
Ko se tekočina ohladi, se v epruveto ob steni doda približno 9 kapljic koncentriranega natrijevega hidroksida, kar je presežek za postopek. Reakcija medija postane alkalna. Vsebina v tubi postane oranžna.
Funkcije
Ker se ksantoprotein imenuje kvalitativni odziv na beljakovine podz delovanjem dušikove kisline, potem se preskus izvede pod priloženo dimno napo. Pri delu s koncentriranimi jedkimi snovmi upoštevajte vse varnostne ukrepe.
Med procesom segrevanja se lahko vsebina cevi izvrže, kar je treba upoštevati pri pritrditvi v držalo in izbiri naklona.
Jemanje koncentrirane dušikove kisline in natrijevega hidroksida se sme izvajati samo s stekleno pipeto in gumijasto žarnico, prepovedano je tipkati z usti.
Primerjalna reakcija s fenolom
Za ponazoritev postopka in potrditev prisotnosti fenilne skupine se podoben test izvede s hidroksibenzenom.
V epruveto vnesite 2 ml razredčenega fenola, nato pa postopoma ob steni dodajte 2 ml koncentrirane dušikove kisline. Raztopina se segreje, zaradi česar postane rumena. Ta reakcija je kakovostna glede na prisotnost benzenskega obroča.
Proces nitriranja hidroksibenzena z dušikovo kislino spremlja tvorba zmesi paranitrofenola in ortonitrofenola v odstotnem razmerju 15 do 35.
Primerjava želatine
Za dokaz, da reakcija ksantoproteina na beljakovino zazna samo aminokisline z aromatično strukturo, se uporabljajo proteini, ki nimajo fenolne skupine.
V čisto epruveto vnesite 1% raztopino želatine v količini 2 ml. Dodamo ji približno 9 kapljic koncentrirane dušikove kisline. Nastalo zmes segrejemo. Raztopina ne porumeni, kar dokazuje odsotnostaminokisline z aromatično strukturo. Včasih opazimo rahlo porumenelost medija zaradi prisotnosti beljakovinskih nečistoč.
Kemične enačbe
Reakcija ksantoproteinov na beljakovine poteka v dveh stopnjah. Formula prve stopnje opisuje proces nitriranja molekule aminokisline z uporabo koncentrirane dušikove kisline.
Primer je dodajanje nitro skupine tirozinu, da nastane nitrotirozin in dinitrotirozin. V prvem primeru je na benzenski obroč vezan en radikal NO2, v drugem primeru pa sta dva atoma vodika zamenjana z NO2. Kemično formulo ksantoproteinske reakcije predstavlja interakcija tirozina z dušikovo kislino, da se tvori molekula nitrotirozina.
Proces nitriranja spremlja prehod brezbarvne barve v rumen ton. Pri izvajanju podobne reakcije z beljakovinami, ki vsebujejo aminokislinske ostanke triptofana ali fenilalanina, se spremeni tudi barva raztopine.
Na drugi stopnji produkti nitriranja molekule tirozina, zlasti nitrotirozina, medsebojno delujejo z amonijevim ali natrijevim hidroksidom. Rezultat je natrijeva ali amonijeva sol, ki je rumeno-oranžne barve. Ta reakcija je povezana s sposobnostjo molekule nitrotirozina, da preide v kinoidno obliko. Kasneje iz nje nastane sol dušikove kisline, ki ima kinonski sistem dvojno konjugiranih vezi.
Tako se konča reakcija ksantoproteina na beljakovine. Druga enačbastopnja je predstavljena zgoraj.
Rezultati
Med analizo tekočin v treh epruvetah služi kot referenčna raztopina razredčen fenol. Snovi z benzenskim obročem dajejo kvalitativno reakcijo z dušikovo kislino. Posledično se spremeni barva raztopine.
Kot veste, želatina vključuje kolagen v hidrolizirani obliki. Ta beljakovina ne vsebuje aromatskih aminokarboksilnih kislin. Pri interakciji s kislino se barva medija ne spremeni.
V tretji epruveti opazimo pozitivno ksantoproteinsko reakcijo na beljakovine. Zaključek lahko naredimo takole: vsi proteini z aromatično strukturo, pa naj gre za fenilno skupino ali indolni obroč, spremenijo barvo raztopine. To je posledica tvorbe rumenih nitro spojin.
Izvedba barvne reakcije dokazuje prisotnost različnih kemičnih struktur v aminokislinah in beljakovinah. Primer želatine kaže, da vsebuje aminokarboksilne kisline, ki nimajo fenilne skupine ali ciklične strukture.
Ksantoproteinska reakcija lahko pojasni porumenelost kože, ko se nanjo nanese močna dušikova kislina. Mlečna pena bo pridobila enako barvo, če se z njo opravi takšna analiza.
V medicinski laboratorijski praksi se ta barvni vzorec ne uporablja za odkrivanje beljakovin v urinu. To je posledica rumene barve samega urina.
Ksantoproteinska reakcija se vse bolj uporablja za kvantificiranje aminokislin, kot sta triptofan in tirozin v različnih beljakovinah.
