Rekombinantna DNK so molekule, ki nastanejo z laboratorijskimi tehnikami genetske rekombinacije za združevanje genetskega materiala iz več virov. Možno je, ker imajo molekule DNK vseh organizmov enako kemično strukturo in se razlikujejo le po zaporedju nukleotidov v njej.
Ustvarjanje
Molekularno kloniranje je laboratorijski proces, ki se uporablja za ustvarjanje rekombinantne DNK. Je ena izmed dveh najbolj razširjenih metod, skupaj s polimerazno verižno reakcijo (PCR). Omogoča vam nadzor nad podvajanjem katere koli določene sekvence DNK, ki jo izbere eksperimentator.
Obstajata dve temeljni razliki med metodami rekombinantne DNK. Ena je, da molekularno kloniranje vključuje replikacijo v živi celici, medtem ko PCR vključuje in vitro. Druga razlika je v tem, da prva metoda omogoča rezanje in lepljenje zaporedij DNK, druga pa je izboljšana s kopiranjem obstoječega vrstnega reda.
Vektorska DNK
Za pridobitev rekombinantne DNK je potreben vektor za kloniranje. Izhaja iz plazmidov ali virusov in je relativno majhen segment. Izbira vektorja za molekularno kloniranje je odvisna od izbire gostiteljskega organizma, velikosti DNK, ki jo je treba klonirati, in od tega, ali je treba ekspresirati tuje molekule. Segmente je mogoče kombinirati z različnimi metodami, kot je kloniranje restrikcijskega encima/ligaze ali Gibsonova montaža.
kloniranje
V standardnih protokolih kloniranje vključuje sedem korakov.
- Izberi gostiteljski organizem in vektor kloniranja.
- Pridobitev vektorja DNK.
- Tvorba klonirane DNK.
- Ustvarjanje rekombinantne DNK.
- Vnos v gostiteljski organizem.
- Izbor organizmov, ki ga vsebujejo.
- Izbor klonov z želenimi vložki DNK in biološkimi lastnostmi.
Po presaditvi v gostiteljski organizem se lahko tuje molekule, ki jih vsebuje rekombinantni konstrukt, izrazijo ali pa ne. Izražanje zahteva prestrukturiranje gena, da se vključijo zaporedja, ki so potrebna za proizvodnjo DNK. Uporablja ga gostiteljev prevajalski stroj.
Kako deluje
Rekombinantna DNK deluje, ko gostiteljska celica izraža protein iz rekombinantnih genov. Izražanje je odvisno od obdajanja gena z nizom signalov, ki zagotavljajo navodila za njegovo transkripcijo. Vključujejo promotor, vezavo ribosomov in terminator.
Težave nastanejo, če genvsebuje introne ali signale, ki delujejo kot terminatorji za bakterijskega gostitelja. To vodi do predčasne prekinitve. Rekombinantni protein se lahko nepravilno obdela, zloži ali razgradi. Njegova proizvodnja v evkariontskih sistemih se običajno pojavi pri kvasovkah in nitastih glivah. Uporaba živalskih kletk je težavna zaradi potrebe po močni podporni površini za mnoge.
Lastnosti organizmov
Organizmi, ki vsebujejo rekombinantne molekule DNK, imajo očitno normalne fenotipe. Njihov videz, obnašanje in presnova se običajno ne spremenijo. Edini način za dokazovanje prisotnosti rekombinantnih zaporedij je pregled same DNK s testom verižne reakcije s polimerazo.
V nekaterih primerih ima lahko rekombinantna DNK škodljive učinke. To se lahko zgodi, ko se njegov fragment, ki vsebuje aktivni promotor, nahaja poleg predhodno tihega gena gostiteljske celice.
Uporabi
Tehnologija rekombinantne DNK se pogosto uporablja v biotehnologiji, medicini in raziskavah. Njegove beljakovine in druge izdelke lahko najdete v skoraj vsaki zahodni lekarni, veterinarski ambulanti, zdravniški ordinaciji, medicinskem ali biološkem laboratoriju.
Najpogostejša uporaba je v osnovnih raziskavah, kjer je tehnologija bistvena za večino današnjega dela v bioloških in biomedicinskih znanostih. Rekombinantna DNK se uporablja za identifikacijo, preslikavo in sekvenciranje genov ter za njihovo določanjefunkcije. Sonde rDNA se uporabljajo za analizo genske ekspresije v posameznih celicah in tkivih celih organizmov. Rekombinantni proteini se uporabljajo kot reagenti v laboratorijskih poskusih. Nekaj konkretnih primerov je navedenih spodaj.
Rekombinantni kimozin
Kimozin, ki ga najdemo v sibiču, je encim, potreben za izdelavo sira. To je bil prvi gensko spremenjen aditiv za živila, uporabljen v industriji. Mikrobiološko proizveden rekombinantni encim, ki je strukturno identičen encimu, pridobljenemu iz teleta, je cenejši in proizveden v večjih količinah.
Rekombinantni humani insulin
Praktično nadomeščen insulin, pridobljen iz živalskih virov (npr. prašiči in govedo) za zdravljenje inzulinsko odvisne sladkorne bolezni. Rekombinantni inzulin se sintetizira z vnosom gena človeškega insulina v bakterije iz rodu Eterichia ali kvasovke.
rastni hormon
Predpisano za bolnike, pri katerih hipofiza ne proizvaja dovolj rastnega hormona za normalen razvoj. Preden je bil na voljo rekombinantni rastni hormon, so ga pridobivali iz hipofize trupel. Zaradi te nevarne prakse so nekateri bolniki razvili Creutzfeldt-Jakobovo bolezen.
rekombinantni koagulacijski faktor
To je beljakovina za strjevanje krvi, ki se daje bolnikom z oblikami hemofilije z motnjami strjevanja krvi. Ne morejo proizvajatifaktor VIII v zadostnih količinah. Pred razvojem rekombinantnega faktorja VIII je bil protein narejen s predelavo velikih količin človeške krvi več darovalcev. To je pomenilo zelo veliko tveganje za prenos nalezljivih bolezni.
Diagnoza okužbe s HIV
Vsaka od treh široko uporabljenih metod za diagnosticiranje okužbe s HIV je bila razvita z uporabo rekombinantne DNK. Test protiteles uporablja njene beljakovine. Zazna prisotnost genskega materiala HIV z verižno reakcijo polimeraze z reverzno transkripcijo. Razvoj testa je bil omogočen z molekularnim kloniranjem in sekvenciranjem genomov HIV.
