Pretočna citometrija je citološka raziskovalna metoda, ki se uporablja za poglobljeno analizo celic. Njegova prednost je, da omogoča preučevanje vsake celice posebej. Ta vrsta analize pomaga oceniti več parametrov v stotinah celic v nekaj sekundah. Kot rezultat, citofluorimetrija velja za eno najhitrejših in najnatančnejših analiz, ki so trenutno na voljo znanstvenikom in klinikom.
Načelo
Načelo pretočne citometrije temelji na merjenju sipanja svetlobe in luminescence (fluorescence) celic. Celična suspenzija se kot tok z veliko hitrostjo pretaka skozi celico citometra, kjer se obseva z laserjem. Tam se izvaja tudi tako imenovano hidrodinamično fokusiranje. Njegov mehanizem je, da tok iz celice s proučevanimi delci na izstopu teče v zunanji curek, ki ima večjo hitrost. Posledično so delci poravnani v urejeno verigo.
Pre-celice so označene s posebnimi fluorescentnimi barvili (fluorokromi). Zahvaljujoč jim laserski žarekvzbuja sekundarni sijaj. Prejete svetlobne signale registrirajo detektorji. Nato se informacije obdelajo s programskimi algoritmi, ki vam omogočajo štetje posameznih celičnih populacij, ki se razlikujejo po nekaterih kriterijih.
Raziskave s konvencionalno mikroskopijo pogosto ne ločijo med različnimi celicami, ker so videti enako. Citofluorimetrija lahko zagotovi druge podatke (celovitost strukture DNK), analizira ekspresijo beljakovin, preživetje celic.
Ker so za vzbujanje fluorokromov potrebni svetlobni žarki različnih valovnih dolžin, pa tudi različne vrste detektorjev, so sodobne instalacije opremljene z več detekcijskimi kanali (od 4 do 30). Število laserskih oddajnikov je lahko od 1 do 7. Kompleksnejše naprave omogočajo večparametrske študije več lastnosti delcev hkrati.
Prednosti in slabosti
Prednosti pretočne citometrije vključujejo:
- visoka hitrost obdelave (registracija do 30 tisoč dogodkov v 1 sekundi);
- možnost preučevanja velikega števila celic (do 100 milijonov v vzorcu);
- Kvantifikacija intenzivnosti fluorescenčne svetlobe;
- analiza vsake celice;
- hkratno preučevanje heterogenih procesov;
- samodejno ločevanje podatkov po celičnih populacijah;
- kakovostna vizualizacija rezultatov.
Druga značilnost te tehnologije je taanalizirani delec lahko obarvamo z več fluorescentnimi raztopinami. Zahvaljujoč temu pride do študije več parametrov.
Slabosti vključujejo zapletenost tehnične opreme in potrebo po posebni pripravi vzorcev.
citometri
Prve tovrstne naprave so se pojavile že leta 1968 v Nemčiji, vendar so postale razširjene veliko pozneje. Trenutno lahko vse naprave, ki delujejo po metodi pretočne citometrije, razdelimo na 2 vrsti:
- naprave, ki merijo fluorescenčno sevanje (dve ali več valovnih dolžin), 10° in 90° sipanje svetlobe (detektor nizkega kota in stranskega razprševanja);
- naprave, ki se poleg merjenja več celičnih parametrov samodejno razvrščajo v skupine v skladu s temi merili.
Detektor razpršitve naprej je zasnovan za določanje velikosti celice, stranska razpršilna naprava pa vam omogoča pridobivanje informacij o prisotnosti znotrajceličnih zrnc, volumskem razmerju citoplazme in jedra.
Klasični citometri, za razliko od svetlobnih mikroskopov, ne omogočajo pridobitve slike celice. Vendar pa so v zadnjih letih razvili kombinirane naprave, ki lahko združujejo zmogljivosti mikroskopa in citofluorimetra. O njih bomo razpravljali spodaj.
Slikovni citometri
Za instrumente, ki se uporabljajo v klasični pretočni citometriji,značilna je ena značilnost: če so v populaciji analiziranih celic registrirani redki dogodki, potem ni mogoče oceniti, kaj je njihovo bistvo. Ti delci so lahko bodisi ostanki mrtvih celic ali njihova redka skupina. Pri običajnih napravah so takšni podatki izključeni iz splošnega toka dogodkov, vendar so prav ti lahko še posebej pomembni za znanstveno in klinično analizo.
Nova generacija slikovnih pretočnih citometrov vam omogoča, da zajamete sliko vsake celice, ki poteka v toku skozi detektorsko območje. To je enostavno videti s klikom na ustrezno območje diagrama, ki je prikazano na računalniškem monitorju.
Območja uporabe
Pretočna citometrija je univerzalna metoda, ki se uporablja na številnih področjih medicine in znanosti:
- imunologija;
- onkologija;
- transplantologija (presaditev rdečega kostnega mozga, izvornih celic);
- hematologija;
- toksikologija;
- biokemija (merjenje kislosti znotraj celice, študij drugih parametrov);
- farmakologija (ustvarjanje novih zdravil);
- mikrobiologija;
- parazitologija in virologija;
- oceanologija (študija fitoplanktona za oceno stanja vodnih teles in druge naloge);
- nanotehnologija in analiza mikrodelcev.
Imunologija
Človeški imunski sistem je sestavljen iz najrazličnejših celic. Pretočna citometrija v imunologiji omogoča oceno njihove strukture in funkcij, torej izvajanje morfofunkcionalnihanaliza.
Takšne raziskave pomagajo razumeti kompleksno naravo imunosti. Celični fenotipi se spreminjajo zaradi aktivacije z antigeni, razvoja patologij in drugih dejavnikov. Citofluorometrija lahko loči subpopulacije imunskih celic v kompleksni mešanici in oceni vse njihove spremembe skozi čas.
Onkologija
Ena najpomembnejših nalog v onkologiji je diferenciacija celic glede na njihov tip. Načelo analize s pretočno citometrijo v onkohematologiji temelji na naslednjem pojavu: ko se vzorec obdela s posebnim fluorescentnim barvilom, se veže na citoplazmatske proteine. Po delitvi v aktivno proliferirajočih celicah se njegova vsebnost zmanjša za polovico. V skladu s tem se intenzivnost celične luminiscence dvakrat zmanjša.
Obstajajo tudi drugi načini za odkrivanje proliferirajočih celic:
- uporaba barvil, ki vežejo DNK (propidijev jodid);
- uporaba označenega uracila;
- registracija povečane stopnje izražanja ciklinskih proteinov, ki sodelujejo pri regulaciji celičnega cikla.
